茶山弘美 准教授
広島大学大学院医系科学研究科 医療人大学院教育・研究センター
PHS: 3540, E-mail: habe@hiroshima-u.ac.jp
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細胞培養、核酸、タンパクレベルでの発現解析を行う。演習を通して分子生物学的実験手法の基礎を習得するとともに、ゲノムから生体内で機能するタンパク質までの発現制御メカニズムを理解する。
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前期、後期ともに開講しています。後期はAグループのみです。日程などの詳細はシラバスを確認してください。
| 演習# | 日時 | テーマ | 内容 |
|---|---|---|---|
| 1 |
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核酸、タンパク、細胞について、細胞継代 | 核酸, タンパク質、遺伝子発現調節、細胞について分子生物学の基礎を復習する。また、培養細胞の継代を行う。 |
| 2 |
| 細胞培養、遺伝子導入 | 培養細胞への薬剤添加後、細胞を回収する。また、薬剤添加により誘導された遺伝子発現を調べる際のポジティブコントロールとして使用するため、リポフェクション法による培養細胞への遺伝子導入を行う。 |
| 3 |
| タンパク抽出、発現確認 part 1 | Bradford法によるタンパク質の定量を行い、SDS-PAGE、western blottingにより目的タンパク質（薬剤添加によりリン酸化されたタンパク質）の発現を確認する |
| 4 |
| タンパク抽出、発現確認 part 2 | |
| 5 |
| 核酸抽出 | 回収した細胞の可溶化、RNA精製を行い、吸光度計にてトータルRNAの濃度、純度を確認する。得られたトータルRNAを用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成する。 |
| 6 |
| PCR、電気泳動、定量 part 1 | primerを設計し、PCR法にて目的の遺伝子を増幅させ、アガロースゲル電気泳動により特異的な遺伝子増幅を確認する。また、real time PCR法により目的遺伝子（薬剤添加により誘導された遺伝子）の発現量を定量する。 |
| 7 |
| PCR、電気泳動、定量 part 2 | |
| 8 |
| 解析、評価 | 薬剤添加による特異的遺伝子の発現量の変化について、結果の視覚化、統計解析による実験結果の評価を行う。Real time PCR法によるmRNAレベル、Western blottingによるタンパク発現解析の結果を総合して薬剤添加により細胞内で起こった現象について評価する。さらに、希望者がいれば結果をプレゼンテーションしてもらう。 |
